Druga faza nitryfikacji, a zatem przeistoczenie kwasu azotawego (azotynów), w kwas azotowy (azotany), odbywa się przy udziale „nitrobakterii”. Nitrobakterie są to tlenowce, ruchu własnego pozbawione, mają one postać wrzecionowatych laseczek. „Optimum” temperatury wynosi dla nich, podobnie jak dla nitrozobakterii, około 37 stopni C., do zabicia jednak konieczną jest temperatura cokolwiek wyższa niż u tamtych, mianowicie około 55 stopni C., przy co najmniej pięciominutowym działaniu. Węgiel czerpią nitrobakterie z togo samego źródła, co i bakterie azotyno-twórcze, energii niezbędnej do tego procesu dostarcza im ciepło, wywiązujące się przy utlenieniu azotynów.

Dodać tu jeszcze trzeba, że nitrobakterie rozpoczynają swą działalność dopiero z chwilą powstania azotynów w środowisku ulegającym nitryfikacji, nitryfikować amoniaku nie są ono w stanie.